Interactions of the 18.5-kDa isoform of myelin basic protein with Ca²⁺-calmodulin

The interactions of the 18.5-kDa isoform of myelin basic protein (MBP) with calmodulin (CaM) in vitro have been investigated using fluorescence microscopy and spectroscopy. Two forms of MBP were used: the natural bovine C1 charge isomer (bMBP/C1) and a hexahistidine-tagged recombinant murine product (rmMBP), with only minor differences in behaviour being observed. Fragments of each protein generated by digestion with cathepsin D (EC 3.4.23.5) were also evaluated. Using fluorescence microscopy, it was shown that MBP and CaM interacted in the presence of Ca²⁺ under a variety of conditions, including high urea and salt concentrations, indicating that the interaction was specific and not merely electrostatic in nature. Using cathepsin D digestion fragments of MBP, it was further shown that the carboxyl-terminal domain of MBP interacted with Ca²⁺-CaM, consistent with our theoretical prediction. Spectroscopy of the intrinsic fluorescence of the sole Trp residue of MBP showed that binding was cooperative in nature. The dissociation constants for formation of a 1:1 MBP-Ca²⁺-CaM complex were determined to be 2.1 ± 0.1 and 2.0 ± 0.2 μM for bMBP/C1 and rmMBP, respectively. Fluorescence spectroscopy using cathepsin D digestion fragments indicated also that the carboxyl-terminal region of each protein interacted with Ca²⁺-CaM, with dissociation constants of 1.8 ± 0.2 and 2.8 ± 0.9 μM for the bMBP/C1 and rmMBP fragments, respectively. These values show a roughly 1000-fold lower affinity of MBP for CaM than other CaM-binding peptides, such as myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, that are involved in signal transduction.

L'interaction de l'isoforme de 18,5 kDa de la protéine basique de la myéline (MBP) avec la calmoduline (CaM) a été étudiée in vitro à l'aide de la spectrofluoroscopie et de la microscopie en fluorescence. Deux formes de MBP ont été utilisées: l'isomère de charge C1 de boeuf (bMBP/C1) naturel et une protéine recombinante de souris ayant six résidus histidine (rmMBP); ces deux formes n'ont que des différences mineures de comportement. Des fragments de digestion de chaque protéine par la cathepsine D (EC 3.4.23.5) ont également été étudiés. Selon la microscopie en fluorescence, la MBP et la CaM interagissent en présence de Ca²⁺ dans diverses conditions, telles des concentrations élevées de sel et d'urée, ce qui indique que l'interaction est spécifique et non seulement électrostatique. En utilisant les fragments de digestion de la MBP par la cathepsine D, nous démontrons également que le domaine C-terminal de la MBP interagit avec la CaM-Ca²⁺, ce qui est en accord avec notre hypothèse. La spectroscopie de la fluorescence intrinsèque du seul résidu tryptophane de la MBP montre que la liaison est coopérative. Les constantes de dissociation pour la formation d'un complexe MBP-CaM-Ca²⁺ 1:1 sont 2,1 ± 0,1 et 2,0 ± 0,2 μM respectivement pour la bMBP/C1 et la rmMBP. La spectrofluoroscopie des fragments de digestion par la cathepsine D montre également que la région C-terminale de chaque protéine interagit avec la CaM-Ca²⁺; dans ce cas, les constantes de dissociation sont 1,8 ± 0,2 et 2,8 ± 0,9 μM respectivement pour les fragments de la bMBP/C1 et de la rmMBP. Ces valeurs montrent que la MBP a environ mille fois moins d'affinité pour la CaM que les autres peptides se liant à la CaM qui interviennent dans la transduction d'un signal, tel le polypeptide MARCKS. [Traduit par la Rédaction]